小质谱创新应用 | 基于薄层色谱二维分离与喷雾电离的小型质谱即时检测新方法

为了克服传统实验室质谱分析在面对即时检测（POCT）需求时的局限性，中国检验检疫科学研究院首席专家马强研究员团队在Analytical Chemistry上发表文章《Improved Point-of-Care Mass Spectrometry Analysis with Thin-Layer Chromatography-Based Two-Dimensional Separation and Spray Ionization》，研究中建立了一种创新性的小型质谱即时检测方法（图1），将薄层色谱（TLC）二维分离、喷雾电离技术与小型质谱仪联用，实现了对复杂生物样品中脑胶质瘤生物标志物——γ-氨基丁酸（GABA）、2-羟基戊二酸（2-HG）和N-乙酰-L-天冬氨酸（NAA）的快速即时分析。文中还提出了TLC原位衍生和双阳离子型离子液体（DIL）诱导电荷反转策略，显著提高了质谱检测灵敏度。该方法未来有望用于临床术中样品的现场即时分析，为临床决策提供即时、准确的信息。

图1. 薄层色谱二维分离、喷雾电离技术结合小型质谱仪的POCT分析流程。

研究方法

薄层色谱：首先，在尺寸为5 cm × 7.5 cm预涂硅胶的铝箔板上进行第一维TLC分离，用正丁醇/甲酸/水（8:3:2，v/v/v）进行洗脱。目标生物标志物经茚三酮/溴甲酚绿衍生后可视化。然后，将TLC板切割成等边三角形，固定后添加喷雾溶剂并施加高压，从而诱导第二维TLC分离，三角形TLC板尖端产生喷雾液滴后，进行后续的微型质谱（mini β，来源于北京清谱科技有限公司）分析。

结果与讨论

一维TLC条件的优化

通过实验优化，选定硅胶涂层的铝箔板为TLC基质、正丁醇-甲酸-水三元混合溶剂为洗脱剂、茚三酮/溴甲酚绿作为染色剂以确定各目标物的TLC洗脱行为。

二维TLC条件的优化

首先，通过单因素实验确定了三角形TLC板尖端角度为60°、含有0.5%氨的甲醇-水（6:4，v/v）为喷雾溶剂、喷雾溶剂体积为5 μL、TLC板与进样口距离为5 mm，喷雾电压为4.25 kV。基于单因素实验结果，进一步采用响应面法考察了喷雾溶剂体积、TLC板与进样口距离及喷雾电压对信号强度的影响，最终确定了最佳实验条件：喷雾电压4.25 kV、TLC板与进样口距离5 mm、喷雾溶剂体积7 μL。

小型质谱分析

在负离子模式下，分析3种脑胶质瘤生物标记物。通过调节仪器参数，以实现最高的检测灵敏度。目标物及其同位素内标的MS/MS谱图如图2所示。

图2. 负离子模式下，GABA (a), GABA-d6 (b), 2-HG (c), 2-HG-d4 (d), NAA (e), NAA-d3 (f)的MS/MS谱图。

TLC原位衍生化与反应喷雾电离

类固醇物质电离效率低，本研究中以表睾酮（EpiT）作为代表性分析物，通过TLC原位衍生化与反应喷雾电离技术，来提高其检测灵敏度。EpiT经羟胺衍生后，分析灵敏度可提高4.3倍（图3）。

图3. (a) 衍生前EpiT在负离子模式下的全扫描质谱；(b) 经羟胺衍生后EpiT在正离子模式下的MS/MS谱图。

TLC原位DIL诱导电荷反转策略

以PFHpA、PFOA和PFNA三种代表性全氟烷基和多氟烷基物质（PFASs）为目标物，进一步考察了TLC原位DIL诱导电荷反转策略。负离子模式下，目标物的信号强度较低。在第二维TLC分离时引入DIL后，可形成带正电荷的复合物，显著提高目标物在正离子模式下的检测灵敏度。结果表明，三种PFASs的分析灵敏度提高了3.3至12.6倍（图4）。

图4. 在负离子模式下PFHpA (a)、PFOA (c)和PFNA (e)的全扫描质谱图；在正离子模式下PFHpA (b)、PFOA (d)和PFNA (f)经DIL诱导电荷反转后的MS/MS谱图。

方法学验证与应用

作者对所开发的方法进行了性能评估，包括LOD、LOQ、线性、重复性、回收率和基质效应，结果如表1所示。与纸喷雾电离方法相比，本研究方法的灵敏度更高。该方法成功应用于临床血清样本的分析，并与传统LC-MS方法进行了比较。与其他已报道的方法相比，该方法在POCT应用中展示出广阔前景。

表1.七种化合物的校准曲线、相关系数、LODs、LOQs和回收率

结论

在这项研究中，作者开发了一种薄层色谱二维分离、喷雾电离与小型便携式质谱联用技术，实现了对复杂生物样品中三种脑胶质瘤生物标志物的快速分析。此外，还探索了TLC原位衍生和DIL诱导电荷反转策略，有效提高了EpiT和PFASs的质谱检测灵敏度。该方法在POCT中展现出巨大应用潜力，未来有望应用于临床术中诊疗场景，从而解决现有检测方法导致的临床决策延迟问题。