小质谱创新应用 | 小质谱助力新方法的建立：内源性蛋白复合物分析

近日，中国检验检疫科学研究院首席专家马强研究员团队在Talanta发表科研文章“Aptamer-functionalized magnetic blade spray coupled with a nucleic acid dye-based mass tag strategy for miniature mass spectrometry analysis of endoglin”。在研究中，开发了一种适配体功能化和核酸染料（GelRed）负载的质谱探针（AGMP），结合基于磁性刀片喷雾（MBS）技术的小型质谱仪，分析内源性蛋白质复合物的方法。该方法具有令人满意的性能，还成功应用于血清样本中内皮糖蛋白（CD105）的检测，展示了其在复杂基质中进行敏感和现场生物分子分析的潜力。

图1.AGMP基于磁性刀片喷雾（MBS）与小质谱联用用于CD105检测

方法背景与方法开发

涂层刀片喷雾（CBS）作为一种基于固相微萃取（SPME）的技术，通过在刀片尖端的涂层有选择性地从复杂基质中富集分析物，然后使用少量有机溶剂进行解吸和电离。磁性刀片喷雾（MBS）则是使用免疫磁珠代替CBS表面涂层，可进一步提高了方法的选择性。

适配体功能化材料具有稳定性、可控修饰、高亲和力和特异性等优点，适合直接与原位电离结合，用于复杂基质中痕量分析物的检测。

内皮糖蛋白（CD105）是一种I型膜糖蛋白，在纤维化和血管生成中起着关键作用，它既是癌症肿瘤血管生成的诊断和预后血清标志物，也是组织标志物。检测血清中的CD105对癌症诊断具有重要意义。目前的检测方法通常面临制备复杂、耗时和成本方面的限制。需要有创新实用的方法进行替代。

本研究开发了一种基于适配体功能化的核酸染料(GelRed)作为质量标记的质谱探针(AGMP)，结合磁性刀片喷雾(MBS)技术，用于高灵敏度分析CD105。

AGMP中使用的CD105适配体首先通过三轮CE-SELEX筛选，并进行了全面评估，包括亲和力测定、基序分析和结合位点预测。选择了具有最佳亲和力的End-A2作为适配体，核酸染料GelRed作为质量标签，来制备AGMP。

图2.AGMP基于磁性刀片喷雾（MBS）与小质谱联用用于CD105检测机理示意图。(A) 使用AGMP进行染料装载、CD105吸附和染料解吸；(B) 磁性刀片喷雾电离；(C) 微型质谱分析。

方法评估

使用清谱科技小型质谱仪 Mini β 验证了AGMP基于MBS分析CD105的可行性。

1. 方法有效性

通过小质谱系统获得了GelRed和内标(IS)的特征性质谱碎裂模式，用于化学鉴定和确认，比较孵育前（图3A）和孵育后（图3B）的质谱强度，证明了AGMP能够有效地与CD105结合。

图3小型质谱仪获得的AGMP与0 ng/mL（A）和50 ng/mL（B）CD105孵育后的质谱图；（C）在同一浓度范围1-50 ng/mL中，基质溶液（蓝色）和标准溶液（红色）的校准曲线。

2.方法线性、检测限与基质效应

通过绘制GelRed/IS的质谱强度比与CD105蛋白浓度的校准曲线（图3C，红色曲线），检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.2 ng/mL和1.0 ng/mL。通过比较基质溶液和标准溶液校准曲线的斜率，评估了该方法的基质效应如图4C（蓝色曲线）所示，基质匹配的校准曲线与标准溶液校准曲线相比，斜率偏差仅为10.03%，表明该方法可以有效减轻基质效应。

3.实际样本检测适用性

构建的AGMP用于检测血清中的CD105，以验证其在实际样本分析中的适用性。测得三个血清样本的回收率在90.1%至106.8%之间，相对标准偏差（RSD）在1.6%至5.4%之间。显示出良好的准确性和稳定性。跟其他方法相比，跟小质谱结合检测的方法具有良好的特异性和灵敏度。

表1使用AGMP检测掺杂血清样本中的CD105

绿色评估

使用GAPI、AGREE和BAGI三个不同的指标评估了该方法对环境的影响，显示出与传统分析方法相比，该方法在环境友好性方面的显著提高。

图4 对所提出方法的绿色评估。(A) GAPI，(B) AGREE 和 (C) BAPI 结果。

总结

建立了一种新型的适配体功能化和核酸染料（GelRed）负载的质谱探针（AGMP），基于磁性刀片喷雾(MBS）技术，与小型质谱仪联用，用于血清中的CD105选择性高灵敏度检测。该方法具有以下优势：

• 质谱探针结合质谱分析，具有优异的选择性；
• 较抗体更具有经济性优势，提供更大的稳定性；
• 有效减轻基质效应；
• 与小质谱结合，可实现现场检测；
• 良好的环境友好性。